臨床前實驗對試劑的特異性、敏感性等指標進行了評價，雖然臨床前的樣品有一定的代表性，但其樣品是經(jīng)過選擇的，其量畢竟有限，并不能*代表實際應(yīng)用中樣品的情況，因此，在試劑注冊以前，必須進行臨床評價。通過臨床評價，可以預測試劑在實際應(yīng)用中可能遇到的問題，以便在試劑說明書中提醒用戶注意，而且通過臨床評價也可以對臨床前所制定的各項指標(如試劑的臨界值等)進行修正。
一、臨床研究單位
臨床評價應(yīng)至少在三個省級以上單位進行，而且這三個單位應(yīng)代表被檢測物的不同流行區(qū)域，分別為被檢測物的高、中、低的流行區(qū)。如果試劑所用的儀器為常用儀器，三個臨床單位使用不同品牌或不同型號的儀器。在實施臨床考核以前，組織者應(yīng)對將實施l臨床考核單位的檢測能力、所用儀器設(shè)備、人員的熟練操作能力進行評價，而且這種評價應(yīng)在盲法的情況下進行。組織者應(yīng)向各考核單位提供同樣的盲樣，如果評價的試劑為定性試劑，盲樣應(yīng)包括評價試劑特異性、敏感性和性的樣品；如果評價試劑為定量試劑，除包括以上樣品外，還應(yīng)包括線性和量值樣品。所有參與考核單位應(yīng)將檢測樣品的原始數(shù)據(jù)提供給組織者，組織者對檢測結(jié)果進行分析，符合要求者方能參與臨床考核。
二、對照試劑以及對照方法的選擇
目前需要評價的診斷試劑主要分為兩類，一類是*新的診斷試劑，臨床上還沒有同類試劑，對這類試劑的評價相對比較困難，其檢測的準確與否主要通過分析與臨床診斷的符合情況而進行判斷，因此，對這類試劑進行I臨床研究所用的對照方法主要是通過觀察臨床癥狀以及實驗室的相應(yīng)檢測，根據(jù)疾病的診斷標準而進行診斷，分析試劑檢測結(jié)果與臨床診斷的相關(guān)性。對一些結(jié)果不一致的患者還可以對其進行追蹤隨訪，了解其疾病的進程以及預后，比較zui終的相關(guān)性。而且對某些被測物來講，已有相關(guān)的診斷試劑而沒有相同的試劑，也可以用相關(guān)的診斷試劑進行分析和比較。另一類試劑是已有同類產(chǎn)品的試劑，或者是*仿制已有的產(chǎn)品，或者是對已上市產(chǎn)品進行了原材料、工藝、反應(yīng)程序等改進，甚至于改變了試劑的反應(yīng)原理，但被測物是相同的。對這類試劑的評價，可采用已上市的同類產(chǎn)品。但同類產(chǎn)品可能很多，如何選擇參比試劑以及選擇的參比試劑是否合適，對zui終的研究結(jié)果具有一定的影響作用。所用的參比試劑應(yīng)該是在醫(yī)療機構(gòu)廣泛接受的、產(chǎn)生結(jié)果zui為準確的試劑，即其檢測結(jié)果與患者的實際狀態(tài)高度一致。但在實際選擇時應(yīng)該注意，并不是用的實驗室越多以及用的時間越長的試劑，其檢測結(jié)果zui為準確。而且對原材料、工藝、反應(yīng)程序等的改進，或者試劑的反應(yīng)原理改變的試劑，應(yīng)該選擇未改變的相應(yīng)試劑作為參比試劑，以便更好地分析其改變以后的優(yōu)勢或不足。例如，試劑的原材料發(fā)生改變，由原來的裂解抗原改為基因工程抗原，評價時也應(yīng)該用非基因工程原料制備的試劑進行評價，以分析其差異。
三、樣品的選擇
臨床樣品是研究診斷試劑的重要因素，樣品選擇合適與否將明顯影響試劑的評價結(jié)果，為客觀、科學地評價試劑，在選擇樣品時應(yīng)考慮以下幾個方面。①臨床評價樣品，至少大部分評價用樣品應(yīng)來自于自然人群，尚未用同類試劑進行篩查。因為任何試劑的檢測結(jié)果都可能有一定的不正確性，若已用此試劑進行篩選，則其誤差已帶人樣品，會影響評價試劑的客觀性。例如，在評價某試劑的敏感性時，僅采用低敏感性試劑所篩查出來的陽性樣品；或者在評價某試劑的特異性時，僅選擇高特異性試劑所篩查出來的假陽性樣品等，都不能客觀地反映試劑的技術(shù)指標。②要根據(jù)試劑適應(yīng)證的范圍選擇人群。例如，用于獻血員篩選的試劑，將主要選擇獻血員人群；用于臨床診斷的試劑將主要選擇臨床患者；用于健康普查的將選擇健康人群等。但試劑的適應(yīng)證往往針對多種人群，選擇人群時要盡可能地覆蓋適應(yīng)證范圍。③選擇不同地區(qū)的樣品，我國地域?qū)拸V，是一個多民族的國家，不同地區(qū)被測物流行率不同，而且不同地區(qū)被測物表型或含量等也可能不同。對微生物來講，在這方面的影響更為明顯，因為在我國不同地區(qū)，不同微生物的基因型、基因亞型、血清型都有可能不同，而且其差別可能影響試劑的檢測效果。④不同疾病時期的樣品，不同時期被測物的狀態(tài)是不同的，的樣品應(yīng)該是動態(tài)變化的系列樣品，即從樣品中沒有被測物到出現(xiàn)被測物，再到量的動態(tài)變化以及消失或長久持續(xù)下去。但在實際工作中很難獲得這類樣品，為了能反映試劑檢測疾病不同時期的被測物情況，選擇樣品時可選擇處于疾病不同時期的不同患者的樣品，其樣品將包括強陽性、弱陽性以及陰性等。⑤盡可能選擇新鮮樣品對試劑進行評價。若樣品不是新鮮采集的話，應(yīng)分裝保存，盡量保證不同試劑所檢測樣品的狀態(tài)是相似的，避免再次凍融后用另一試劑檢測。
選擇合適的樣品是客觀評價試劑質(zhì)量的重要因素，不同的臨床樣品對試劑的評價結(jié)果是不同的。臨床樣品的選擇應(yīng)具有一定的代表性，否則會影響對試劑的質(zhì)量進行正確評價。如在對注冊前的7家HIV-／2抗體快速檢測試劑進行臨床評價時，共檢測了三類樣品，其中，HIV-抗體強陽性樣品300份、健康獻血員樣品440份，以及高危人群樣品264份(李秀華等，2006a)。結(jié)果顯示，檢測300份HIV-抗體強陽性樣品時均為陽性，未發(fā)現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。檢測440份健康獻血員樣品時，大部分試劑均檢測為陰性，只有個別試劑出現(xiàn)了假陽性的現(xiàn)象，試劑的特異性為97．7％～00％。檢測高危人群樣品時，試劑的特異性除個別試劑較低(僅為59．5％)外，大部分試劑的特異性在95％以上。但試劑的敏感性相差明顯，為77．2％～95．％(表7．)。在264份高危人群樣品中，有63份樣品為HIV抗體陽性。對陽性樣品的強弱進行分析，并以S／CO值表示(表7．2)，大部分樣品的S／CO值為0．0～2．0，為中等強度，而且也有弱陽性和強陽性樣品，具有很好的代表型，因此，反映出了試劑靈敏度的差異。不同試劑的漏檢情況不同。例如，試劑和4漏檢的樣品均為弱陽性樣品，說明是由于靈敏度原因造成的漏檢；而其他試劑在不同強度的樣品中均存在漏檢，說明試劑不僅存在靈敏度偏低的問題，而且也可能存在試劑模式、HOOK效應(yīng)等。以上結(jié)果顯示，不同樣品對試劑質(zhì)量評價的結(jié)果是不一樣的，一個好的、有代表性的樣品庫能夠真實、客觀地反映試劑的技術(shù)指標，而且也能通過對漏檢樣品特性的分析，了解試劑存在的缺陷，為試劑質(zhì)量的提高提供實驗數(shù)據(jù)。
由于樣品處理不同，此過程中的添加物和樣品的不同狀態(tài)等對試劑的檢測結(jié)果可能產(chǎn)生影響，而且試劑不僅適應(yīng)于正常人群，也適應(yīng)于一些特殊人群，尤其是某些特殊疾病的人群，因為其代謝異常，可能會產(chǎn)生影響被測物檢測結(jié)果的代謝產(chǎn)物。因此，在試劑的臨床評價中，應(yīng)充分考慮以下特殊樣品。①樣品的狀態(tài)、樣品儲存條件、凍融次數(shù)和融血等。②樣品處理過程中的添加物，如不同抗凝劑是否影響試劑的檢測結(jié)果，尤其對PCR類試劑可能存在不同的影響。③異常代謝產(chǎn)物，如高免疫球蛋白樣品、高血紅蛋白、高脂樣品、高疸紅素樣品、陽性樣品、免疫系統(tǒng)疾病和孕婦的樣品等。④其他病毒抗原或抗體陽性樣品，抗體陽性的樣品可能對間接法檢測抗體的試劑存在一定的影響，而與被測物存在同源性的抗原可能影響抗原試劑的檢測結(jié)果。如果有些因素影響試劑的檢測結(jié)果，則應(yīng)該在試劑說明書中說明，以便引起使用者的注意，正確地解釋結(jié)果。
四、樣品數(shù)量的確定
臨床研究所用的樣品數(shù)量主要是由被測物的流行率所決定的，應(yīng)該根據(jù)統(tǒng)計學的基本原理選擇適當?shù)臉颖玖?。圖7．對檢測不同樣本數(shù)量所獲得的檢測值與預期值的關(guān)系進行了分析。從表中也可以看到，樣本量過小，所得到的指標不穩(wěn)定，用以推斷總體的精密度和準確度差，檢驗的功效低，應(yīng)有的差別不能顯示出來，難以獲得正確的研究結(jié)果，結(jié)論也缺乏充分的依據(jù)。樣本量越大，參數(shù)的估計越，統(tǒng)計的結(jié)果越有效，越能反映試劑在實際檢測中的技術(shù)指標，但也會增加實際工作的困難。
除了考慮統(tǒng)計因素以外，試劑審批或評價部門也往往對臨床研究的診斷試劑規(guī)定檢測樣本的zui低數(shù)量。例如，我國規(guī)定三類試劑檢測的總樣本數(shù)至少000例，用于血液篩查試劑檢測的總樣本數(shù)至少0 000例(體外診斷試劑的技術(shù)指導原則，國家食品藥品監(jiān)督管理局)。但不同試劑以及同一試劑不同適應(yīng)證等，所需檢測的樣本數(shù)可能不同，要在滿足法規(guī)要求的情況下，選擇合適的樣本數(shù)，以便得出準確的結(jié)果。
美國FDA對HIV抗體快速檢測試劑臨床研究也有樣本數(shù)量的要求，而且zui近也做了一些調(diào)整。這里所指的快速檢測試劑是檢測靜脈全血、手指全血、口腔液體以及血清和血漿樣品的試劑，而且主要是用于對HIV流行情況不清楚人群的新鮮樣品進行的檢測。對試劑靈敏度進行評價時，原來要求至少檢測000例HIV感染者樣品以及500例高危人群中的陽性樣品。但現(xiàn)在FDA要求企業(yè)可以根據(jù)統(tǒng)計學的要求設(shè)計樣品的規(guī)模，但至少檢測500份新鮮的樣品，檢測近期陽轉(zhuǎn)患者的樣品，F(xiàn)DA強烈建議至少檢測000份高危人群樣品分析其靈敏度。對特異性研究，F(xiàn)DA原來要求至少檢測6000例HIV低危人群的新鮮樣品，現(xiàn)在要求企業(yè)可根據(jù)統(tǒng)計學的要求確定樣品數(shù)量，但高危人群和低危人群的新鮮樣品至少各有500份，而FDA強烈建議應(yīng)各000份。要求該類試劑的特異性和敏感性的95％可信限的下限至少達到98％。
歐洲對用于血液篩查的HIV-／2抗體檢測試劑的臨床研究要求是：在評價試劑敏感性時，至少檢測400份HIV-抗體陽性和200份HIV-2抗體陽性的樣品，而且在HIV-l抗體陽性樣品中要至少包括40份非B亞型的樣品，每一個亞型至少有3份樣品；要至少檢測20份陽轉(zhuǎn)血清。在分析試劑特異性時，至少檢測5000份未經(jīng)篩選的獻血員樣品、200份住院患者的樣品(非HIV感染者)，以及00份可能引起交叉反應(yīng)的樣品，如類風濕因子陽性樣品、其他病毒抗體陽性樣品以及孕婦樣品等。
五、檢測程序以及不一致樣品的分析
在評價試劑時為排除一些干擾因素，參比試劑以及考核試劑應(yīng)該在一致的條件下進行檢測。例如，在同一實驗室由同一實驗技術(shù)人員使用相同的加樣儀器以及同樣的處理設(shè)施，甚至于在同一天對樣品進行平行檢測，所有操作將按每一種試劑說明書嚴格進行，而且實驗人員不知道樣品中被測物的實際狀態(tài)，即盲法檢測。
結(jié)果不一致的樣品由同一實驗人員按同樣的方法進行檢測，避免由于技術(shù)操作所產(chǎn)生的實驗錯誤。若還不一致，則由不同的實驗人員或?qū)嶒炇矣猛瑯拥脑噭┮约皩嶒灄l件進行檢測，但他們不知道以前的檢測結(jié)果。盡量避免技術(shù)人員或?qū)嶒炇乙蛩禺a(chǎn)生的錯誤。若仍然不一致，則應(yīng)用其他試劑進一步核對，明確該樣品的狀態(tài)。